Budynek został w swojej obecnej postaci wzniesiony w XVI w., na fundamentach starszej świątyni. Przez pierwsze kilka dziesięcioleci funkcjonowania była to cerkiew prawosławna, po 1596 r. przyjęła unię. W jurysdykcji diecezji chełmskiej pozostawała do jej likwidacji, przeprowadzonej przez władze carskie w 1875 r. W okresie, gdy cerkiew w Szczebrzeszynie należała do unitów, została kilkakrotnie wyremontowana i przebudowana, przez co zatraciła cechy wschodniochrześcijańskiej architektury sakralnej. Na przełomie XVIII i XIX w. do wnętrza świątyni wstawiono wzorowane na łacińskich ołtarze główny i boczne, które usunięto w czasie przebudowy w latach 1867–1870.
Po wejściu w życie ukazu tolerancyjnego cara Mikołaja II zdecydowana większość wiernych parafii szczebrzeszyńskiej, zmuszonych wcześniej do przyjęcia prawosławia, przeszła do Kościoła rzymskokatolickiego. Cerkiew pozostała jednak czynna do 1915 r., tj. do momentu, gdy w mieście przebywali rosyjscy urzędnicy i wojskowi. Po odzyskaniu niepodległości przez Polskę nie została ponownie otwarta, gdyż w Szczebrzeszynie pozostały tylko dwie osoby wyznania prawosławnego. W 1938 r. znajdowała się na liście cerkwi przeznaczonych do zniszczenia w ramach akcji rewindykacyjno-polonizacyjnej, jednak po protestach mieszkańców jej rozbiórka została przerwana.
Po II wojnie światowej obiekt przeszedł na własność Skarbu Państwa. Początkowo użytkowany jako magazyn, a następnie całkowicie porzucony, z czasem uległ całkowitej dewastacji. W 2006 r. zrujnowaną cerkiew otrzymał na własność Polski Autokefaliczny Kościół Prawosławny. W latach 2008–2010 obiekt został poddany gruntownemu remontowi, w czasie którego odkryte i odsłonięte zostały siedemnastowieczne malowidła ścienne, a ikonostas, zniszczony w czasie I wojny światowej, odrestaurowany. Za